Pada percobaan kali ini akan dilakukan Pemetaan DNA Plasmid yang menjadi percobaan lanjutan dari praktikum sebelumnya. Untuk melakukan Pemetaan DNA Plasmid, langkah pertama yang dilakukan adalah sebanyak 15 mL ddH2O dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 mL dengan menggunakan mikropipet. Selanjutnya, sebanyak 2 mL larutan penyangga reaksi 10x (10%) dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang sama. Langkah berikutnya adalah sebanyak 2 mL DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen pada tabung eppendorf yang sama. Langkah terakhir adalah sebanyak 1 mL enzim restriksi (10 unit/mL) dimasukkan pada tabung eppendorf yang sama pula. Enzim restriksi yang digunakan adalah Xho I yang akan memotong pada 8081 bp ke 6987 bp menurut pCAMBIA 1200 vector series yang akan menghasilkan 1094 bp. Percobaan ini dilakukan dengan urutan: ddH2O, larutan penyangga, DNA plasmid, dan enzim sesuai dengan jumlah volume larutan yang terbesar terlebih dahulu sampai volume larutan yang terkecil. Kemudian, larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0C. Perhatikan suhu yang digunakan harus stabil pada suhu 37 0C, sehingga harus dilakukan pemantauan secara berkala untuk memastikan suhu berada pada nilai 37 0C. Setelah selesai dilakukan inkubasi, larutan dapat langsung digunakan atau disimpan pada suhu -20 0C jika akan digunakan di kemudian hari.
Selanjutnya dilakukan prosedur amplifikasi fragmen DNA menggunakan metode Polymerase Chain Reactions (PCR) dengan cara sebanyak 33,6 mL ddH2O (Water Nucleus Free) dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf. Kemudian ditambahkan kromosom (template DNA) sebanyak 1 mL, primer forward 16s rRNA dan primer reserve 16s rRNA masing-masing 2 mL. Kemudian dNTP (10mM) ditambahkan sebanyak 1 mL yang disusul dengan penambahan buffer (dapar) PCR sebanyak 5 mL dan Mg2+ (MgCl2)sebanyak 5 mL. Setelah dilakukan semua pencampuran, langkah selanjutnya adalah dilakukan pengocokkan dengan menggunakan vortex terhadap larutan yang telah dicampur. Sebaiknya untuk menghindari perusakan sel, pengocokkan dilakukan dengan cara membolak-balikkan tabung dengan tangan secara perlahan-lahan. Setelah proses pengocokkan dilakukan, langkah selanjutnya adalah penambahan 5 unit/mL Taq polymerase sebanyak 0,4 mL dan dilakukan proses running. PCR dilakukan dengan tahap denaturasi awal 94 0C selama dua menit; siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 0C selama satu menit, penempelan (annealing) pada suhu 48 0C selama satu menit, dan pemanjangan fragmen DNA oleh Taq polymerase (polimerisasi) pada 72 0C selama satu menit, reaksi dilakukan sebanyak 30 siklus. Pemanjangan fragmen DNA akhir pada 72 0C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis dan hasil elektroforesis dilihat dibawah sinar UV 312 nm menggunakan alat transilluminator UV (Cole-Palmer) dan sebagai penampak bercak digunakan ethidium bromida.
Langkah terakhir adalah dilakukan deteksi fragmen DNA menggunakan elektroforesis gel dengan cara gel agarosa 1% dibuat dengan melarutkan 0,2 g agarosa ke dalam larutan TAE 1x hingga volume 20 mL dalam Erlenmeyer. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna (jernih). Baki gel agarosa disiapkan dengan melekatkan selotip dikedua ujung baki, lalu sisir elektroforesis dipasang pada salah satu ujung baki. Diamkan larutan agarosa hingga bersuhu sekitar 50-60 0C kemudian tambahkan larutan etidium bromide 0,2 mL (1mL/100mL), goyang Erlenmeyer sehingga larutan menjadi homogen. Tuangkan larutan gel ke dalam baki gel agarosa, lalu biarkan sampai beku. Sisir elektroforesis dicabut dengan hati-hati, lalu selotip pada ujung-ujung baki dilepaskan. Gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi larutan dapar TAE 1x. Seluruh permukaan gel harus terendam dalam TAE. Buatlah 10 mL suspense DNA (masing-masing marker, DNA kromosom, DNA plasmid, dan DNA plasmid hasil restriksi) dan 2 mL loading dye 6x di dalam tabung eppendorf 1,5 mL. Homogenkan campuran melalui pemipetan berulang menggunakan mikropipet. Campuran DNA masing-masing dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa. Nomor sumur dan jenis suspensi DNA yang dimasukkan harus dicatat. Kabel dari sumber arus dihubungkan ke tangki elektroforesis, dimana kabel yang tersambung ke kutub negatif harus berada di dekat sumur). Sumber arus dinyalakan , voltase diatur pada 90 volt, kekuatan arus 400 mA dan waktu running selama 45 menit. Elektroforesis di-running dengan menekan tombol run pada sumber arus. Setelah elektroforesis selesai, maka sumber arus dimatikan dan baki diangkat dari tangki elektroforesis. Gel dikeluarkan dari baki elektroforesis (PERINGATAN KERAS !!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). Gel diletakkan di atas transluminator UV. Transluminator dinyalakan, lalu pita-pita DNA yang tervisualisasi diamati (jangan lupa menggunakan kacamata UV). Berat molekul dan kuantitas jumlah DNA diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya terhadap laju migrasi fragmen-fragmen DNA standar (DNA marker).
drutama ~ Amantadin 