Pembahasan Kegiatan 11 (Kuantitasi Mikroba: Hitungan Cawan)

M. Badru Tamamudin (260110100081) Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan tentang kuantitasi mikroba atau perhitungan mikroba. Dimana dalam perhitungan mikroba terdapat 2 metode yang dilakukan, yaitu secara langsung atau tidak langsung. Pada metode secara langsung bisa dengan membuat preparat bahan atau menggunakan ruang hitung. Sedangkan secara tidak langsung terdapat 4 cara, yaitu dengan perhitungan cawan (TPC), pengenceran, calorimeter, dan metode pendekatan (MPN methode). Dalam praktikum pembiakan bakteri dengan metode cawan hitung ini, semua pengerjaan harus dilakukan secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi dari lingkungan luar terhadap sampel ataupun biakan bakteri yang akan dibuat. Pertama-tama saat dilakukan pengenceran sampel, dalam hal ini digunakan sampel berupa air mineral. Diperlukan tiga tabung reaksi dan volume pipet yang sudah disterilisasi terlebih dahulu di dalam autoklaf. Tabung reaksi dikeringkan di dalam oven, namun volume pipet tidak boleh dikeringkan didalam oven karena volume pipet merupakan alat yang mempunyai skala volumetri, jika dikeringkan dengan cara pemanasan akan memuai, sehingga akan berpengaruh dalam perhitungan. Tabung reaksi merupakan wadah untuk pengenceran sampel, sampel diencerkan tiga kali sehingga didapatkan konsentrasi 10-1, 10-2, dan10 -3, masing masing konsentrasi dimasukkan dalam tiap tabung reaksi dan diberi label agar tidak terukar dan memudahkan dalam identifikasi. Volume pipet digunakan untuk memipet dan memindahkan sampel serta aquadest kedalam tabung reaksi. Pada mulut volume pipet harus dipastikan masih terdapat kapas yang menutupi mulut volume pipet tersebut. Hal ini bertujuan agar bakteri yang terdapat dalam sampel tidak terhirup oleh mulut serta bakteri dari mulut juga dapat disaring oleh kapas. Cairan sampel dan aquades dihirup dengan volume pipet yang berbeda lewat mulut, bukan menggunakan bulb pipet. Untuk sampel, digunakan volume piper berskala 5 mL sedangkan untuk aquadest digunakan volume pipet berskala 10 mL. Semua pengerjaan pengenceran harus dilakukan dekat api, namun juga tidak boleh terlalu panas karena suhu yang terlalu panas dapat mematikan bakteri sehingga bakteri tidak dapat tumbuh sementara tujuan dari praktikum ini adalah mengamati pertumbuhan bakteri dengan faktor lingkungan dan nutrisi yang cocok. Pengenceran dilakukan agar dapat dibedakan bagaimana jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada tiap-tiap konsentrasi yang berbeda, bakteri yang tumbuh pada konsentrasi tinggi akan lebih banyak jumlahnya dibandingkan dengan bakteri yang tumbuh pada konsentrasi yang lebih rendah karena induk biakan bakteri lebih banyak terdapat pada konsentrasi yang tinggi, dalam hal ini pada konsentrasi 10-1. Setelah dilakukan pengenceran, tiap-tiap 1 mL sampel dalam masing masing tabung reaksi dipindahkan ke dalam cawan petri. Cawan petri merupakan wadah pertumbuhan bakteri yang nantinya akan dimasukkan ke dalam inkubator. Setelah itu dimasukkan ke dalam masing-masing cawan petri nutrien broth yang merupakan media cair pertumbuhan bakteri. Nutrien Broth sudah dibuat sebelumnya, dimana di dalam tiap liter nutrien broth terkandung banyak protein dan NaCl serta nutrisi pendukung pertumbuhan bakteri lainnya. Nutrien broth berwarna kuning agak kental. Pada pembuatan media agar padat di perlukan takaran agar yang benar. Jika pembuatannya terlalu pekat maka Aw rendah sehingga mikroorganisme tak akan tumbuh dengan baik. Dan sebaliknya jika pembuatan media terlalu encer maka nutrisi sedikit dan hal tersebut menyebabkan mikoorganisme terhambat pertumbuhannya pula. Pada pembuatan agar cawan setelah agar memadat di haruskan meletakan media pada posisi terbalik, hal ini bertujuan agar uap air yang terbentuk ketika di lakukan proses inkubasi tidak menetes pada koloni bakteri. Dan jika sampai ditetesi air maka kemungkinan besar bentuk koloni akan berubah karena sudah terkontaminasi. Media pengencer berfungsi untuk mengencerkan konsentrasi nutrisi dan mengurai koloni mikroorganisme yang bergerombol padat sehingga dapat di amati dan di ketahui jumlah mikroorganisme secara spesifik dan untuk mendapatkan perhitungan yang tepat. Media-media yang dapat di gunakan dalam uji mikrobiologi ini antara lain: 1. PCA (Plate Count Agar): Di gunakan sebagai media pertumbuhan bakteri 2. PDA (Potato Dextrose Agar): Digunakan sebagai media pertumbuhan khamir dan kapang 3. Pepton: sebagai bahan pengencer Awalnya nutrien broth disimpan di dalam erlenmeyer berukuran besar, lalu dituangkan ke dalam tiga tabung reaksi besar yang sebelumnya sudah ditandai sampai batas 9 mL. Dari dalam ketiga tabung reaksi besar tersebut, masing-masing dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi sampel dengan berbagai konsentrasi. Semua pengerjaan dilakukan dekat api untuk memperbesar evaporasi dan dengan hati-hati agar nutrien broth tidak tumpah. Setelah masing-masing cawan petri diisikan nutrien broth, cawan petri diputar perlahan diatas meja laboratorium agar penyebaran nutrien dan bakteri merata di seluruh permukaan cawan petri. Setelah itu, ditunggu sampai membeku. Setelah cairan dalam cawan petri membeku, ketiga cawan petri dibalik agar uap air yang terkondensasi pada bagian tutup cawan petri tidak menetes pada media nutrien broth. Kemudian, ketiga cawan petri yang telah dibalik ditumpuk, maksimal penumpukan hanya 3 cawan petri dan diusahakan posisi tutup tidak miring. Tumpukan cawan dibungkus dengan kertas koran lalu dimasukkan ke dalam inkubaror dengan suhu 350C – 400C (suhu tumbuh bakteri). Sampel diinkubasikan selama ± 18-24 jam dihitung dari waktu dimasukkan ke dalam inkubator. Setelah 18-24 jam, sampel diambil dari inkubator dan dihitung jumlah koloni bakteri di dalam masing-masing cawan. Saat akan dilakukan perhitungan terlihat bahwa bakteri pada cawan 10-1 jauh lebih banyak daripada bakteri pada kedua cawan lainnya. Untuk memudahkan perhitungan, apabila penyebaran bakteri merata cawan petri bisa dilukis menjadi empat kuadran, dihitung salah satu kuadran saja lalu jumlahnya dikalikan empat. Jumlah yang didapat pada masing-masing cawan petri adalah: • Konsentrasi 10-1 = > 300 koloni • Konsentrasi 10-2 = > 300 koloni • Konsentrasi 10-3 = > 300 koloni Yang dimasukkan kedalam perhitungan jumlah koloni bakteri per mL sampel hanya koloni bakteri pada konsentrasi 10-2 dan 10-3 karena keduanya memenuhi jumlah bakteri ideal dalam pembiakan nutrien broth yaitu antara 30-300 koloni. Sedangkan pada konsentrasi 10-1 terlalu banyak koloni, sehingga tidak dipilih. Selanjutnya dipilih range dalam koloni tujuannya adalah untuk meminimalisir kesalahan dalam proses analisa(statistical error). Jika didapat jumlah koloni kurang dari 30 maka: – Kesalahan statistik tinggi. – Sangat sensitif terhadap kontaminan (jumlah bakteri kontaminan yang tidak sengaja masuk, besar pengaruhnya terhadap jumlah akhir koloni per cawan). – Membutuhkan kerja aseptis yang lebih teliti. Solusi yang tepat dalam hal ini adalah memperbesar ukuran sampel. Jika didapat jumlah koloni lebih besar dari 300 maka : – Dimungkinkan ada sifat antagonisme antar spesies, misalnya bakteri A menghambat bakteri B dengan mengeluarkan metabolit tertentu (antibiotik) sehingga bakteri B tidak tumbuh sedangkan keduanya berada diposisi yang berdekatan. – Perebutan nutrisi/kompetisi sangat tinggi yang lama-kelamaan menimbulkan keterbatasan nutrisi. – Kemungkinan dua koloni bergabung menjadi satu lebih besar sehingga mengaburkan jumlah sebenarnya karena dua koloni yang bergabung tetap dihitung satu koloni. Solusi : memperkecil ukuran sampel atau diencerkan. Setelah dihitung jumlah koloni per sampel maka didapatkan jumlah koloni per mililiter air mineral adalah > 300 koloni / ml.